Plasmide CRISPR d'Activation (m) Vangl2: sc-430058-ACT

Vangl2 (Van Gogh-like 2) code un composant central de la voie de polarité planaire des cellules (PCP) qui coordonne des comportements cellulaires polarisés à l’échelle des tissus au cours du développement de la souris. En tant que protéine membranaire à quatre passages transmembranaires, Vangl2 contribue à organiser des complexes PCP asymétriques avec des partenaires tels que Frizzled/Dishevelled et Prickle, influençant l’extension convergente, la division cellulaire orientée et la migration collective. La signalisation dépendante de Vangl2 s’entrecroise avec les voies Wnt non canoniques pour réguler la dynamique du cytosquelette et la morphogenèse des tissus. Un dérèglement de la fonction de Vangl2 est associé à des défauts de PCP et à des phénotypes développementaux, notamment des anomalies de fermeture du tube neural, ce qui en fait une cible utile pour disséquer les processus gouvernés par la polarité.

Vangl2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Vangl2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Vangl2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Vangl2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Vangl2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Vangl2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Vangl2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Vangl2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Vangl2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Vangl2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.