Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase B2: sc-401896-ACT

ATP6V1B2 code pour la sous-unité B2 du domaine périphérique V1 de l’ATPase vacuolaire à protons (V-ATPase), une pompe à protons multisous-unités qui hydrolyse l’ATP afin d’acidifier les endosomes, les lysosomes et d’autres compartiments intracellulaires. Cette acidification des organites est essentielle à l’endocytose médiée par récepteur, au flux autophagique, à l’activation des enzymes lysosomales et au trafic vésiculaire, et elle influence indirectement la détection des nutriments et l’adaptation métabolique liée à mTOR. En régulant le pH luminal, l’activité de la V-ATPase affecte la maturation et le renouvellement des protéines, le traitement des antigènes et le recyclage des protéines membranaires. Des dérégulations des voies d’acidification des vésicules et des lysosomes impliquant des composants de la V-ATPase ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurologiques, ainsi qu’à des troubles plus larges du trafic intracellulaire, faisant d’ATP6V1B2 un point d’entrée utile pour étudier la protéostasie et le dysfonctionnement endolysosomal.

V-ATPase B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V1B2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V1B2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V1B2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase B2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V1B2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase B2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase B2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V1B2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.