Plasmide CRISPR d'Activation (h) UVRAG: sc-402956-ACT

Le gène humain UVRAG (UV radiation resistance associated gene) code un régulateur multifonctionnel de l’autophagie et du trafic endolysosomal, qui contribue au maintien de l’homéostasie cellulaire en situation de stress. UVRAG interagit avec les complexes PI3K de classe III afin de favoriser la maturation des autophagosomes et la fusion autophagosome–lysosome, et participe également au trafic endocytaire et à la dynamique vésiculaire via des interactions avec les machineries d’arrimage et de fusion. Au-delà des voies de dégradation, UVRAG a été associé au maintien de l’intégrité génomique et à la coordination des réponses aux dommages, reliant les systèmes vésiculaires aux programmes de survie cellulaire. La dérégulation des processus associés à UVRAG est fréquemment étudiée dans le contexte de la biologie tumorale, des maladies neurodégénératives et des modèles d’infection, où des altérations de l’autophagie et du trafic membranaire peuvent remodeler le métabolisme, l’inflammation et la protéostasie.

UVRAG Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UVRAG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UVRAG Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UVRAG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UVRAG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UVRAG. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UVRAG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UVRAG au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UVRAG dans les cellules tumorales présentant une expression de UVRAG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.