UNC5H2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402347-ACT

UNC5B kodiert den Netrin-Rezeptor UNC5H2, einen transmembranen Rezeptor für Leitsignale, der über netrinabhängige Signalübertragung sowie durch sein Verhalten als Abhängigkeitsrezeptor in Abwesenheit des Liganden die Axonnavigation, neuronale Migration und das Zellüberleben reguliert. UNC5H2 moduliert über Rho‑Familien‑GTPasen und fokale-Adhäsions-assoziierte Signalwege die Zytoskelettdynamik und Zelladhäsion und beeinflusst dadurch die gerichtete Zellbewegung und die Gewebemusterbildung während der Entwicklung. In nicht-neuronalen Kontexten trägt UNC5B/UNC5H2 zur Organisation von Gefäß- und Epithelgewebe bei und kann Apoptose-, Proliferations- und Invasionsprogramme beeinflussen. Eine Fehlregulation der UNC5B-Signalgebung wurde mit veränderten Phänotypen der Zellmigration und des Zellüberlebens in Zusammenhang gebracht, die für neuroentwicklungsbedingte Erkrankungen und die Krebsbiologie relevant sind, und macht UNC5B zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien von Signalwegen.

UNC5H2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UNC5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UNC5H2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UNC5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UNC5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UNC5H2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UNC5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UNC5H2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UNC5H2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UNC5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.