Plásmido CRISPR de Activación (m) UNC45A: sc-430401-ACT

Unc45a codifica UNC45A, una chaperona conservada dirigida a miosina que coopera con HSP90 para promover el plegamiento adecuado, la estabilidad y el ensamblaje funcional de las proteínas motoras de miosina. Mediante la regulación de la contractilidad actomiosínica y la organización del citoesqueleto, UNC45A contribuye a procesos como el transporte intracelular, la división celular y la migración celular. En sistemas murinos, la perturbación de la actividad de UNC45A puede afectar la morfogénesis tisular y la mecánica celular al alterar la homeostasis de las proteínas motoras y las vías de proteostasis. La expresión o función desregulada de UNC45A se ha vinculado en la literatura con defectos del citoesqueleto y fenotipos proliferativos o migratorios aberrantes, lo que respalda su relevancia para estudios mecanísticos del comportamiento celular asociado a enfermedades.

UNC45A El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Unc45a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UNC45A El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Unc45a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Unc45a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UNC45A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Unc45a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UNC45A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UNC45A en células tumorales con expresión de Unc45a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.