UBPY CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403737-ACT

Das humane Gen **USP8** kodiert das deubiquitinierende Enzym **UBPY**, eine ubiquitin-spezifische Protease, die Ubiquitinketten an Komponenten des endozytotischen Transports sowie an Rezeptorsubstraten bearbeitet, um Protein-Stabilität und -Sortierung zu steuern. UBPY wirkt im endosomalen System in Koordination mit ESCRT-assoziierter Maschinerie und reguliert die Deubiquitinierung von Fracht, das Gleichgewicht zwischen Rezeptor-Recycling und lysosomalem Abbau sowie die Stärke nachgeschalteter Signalübertragung. Über diese Funktionen beeinflusst USP8 Signalwege, die mit Wachstumsfaktorrezeptor-Signalisierung, Vesikeltransport und Proteostase verknüpft sind und häufig an fehlregulierter Zellsignalisierung sowie veränderter endolysosomaler Funktion beteiligt sind. Genetische und funktionelle Studien haben Störungen von USP8 mit krankheitsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, die eine aberrante Rezeptor-Umsatzrate und eine Umverdrahtung von Signalnetzwerken umfassen, was seinen Nutzen als mechanistischen Knotenpunkt in der Forschung zur zellulären Homöostase unterstreicht.

UBPY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USP8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBPY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USP8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USP8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBPY-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USP8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBPY-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBPY-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USP8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.