TS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402479-ACT

Das humane TYMS-Gen kodiert die Thymidylat-Synthase (TS), ein zytosolisches Enzym, das die de-novo-Umwandlung von dUMP zu dTMP katalysiert und damit eine essenzielle Quelle von Thymidylat für die DNA-Replikation und -Reparatur bereitstellt. Durch die Kontrolle der dTTP-Verfügbarkeit unterstützt TS den Fortschritt durch die S-Phase und beeinflusst über die Kopplung an den ein-Kohlenstoff-/folatabhängigen Stoffwechsel die Genomstabilität. Die TYMS-Aktivität ist in Netzwerke der Nukleotidbiosynthese und in Reaktionen auf Replikationsstress eingebunden; veränderte Expression wird häufig im Zusammenhang mit proliferativen Zuständen und der Toleranz gegenüber DNA-Schäden untersucht. Eine Dysregulation von TYMS wurde mit Veränderungen der zellulären Wachstumskontrolle und metabolischer Reprogrammierung in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Nukleotidhomöostase macht.

TS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TYMS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TYMS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TYMS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TYMS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TYMS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.