Plásmido CRISPR de Activación (h) TRPM8: sc-401744-ACT

TRPM8 (miembro 8 de la subfamilia M de los canales catiónicos de potencial receptor transitorio) es un canal iónico permeable al calcio, sensible al frío y al mentol, que regula la excitabilidad de la membrana y la señalización intracelular de Ca2+. En células humanas, la actividad de TRPM8 influye en la transducción sensorial, la respuesta osmótica y térmica, y en vías posteriores acopladas a la señalización transcripcional y de quinasas dependiente de Ca2+. La alteración de la expresión o la función de TRPM8 se ha vinculado con cambios en la señalización neuronal y en el comportamiento de células epiteliales, y se estudia con frecuencia en el contexto de la biología del cáncer, los trastornos del dolor y sensoriales, y procesos asociados a la inflamación. Como canal de membrana plasmática, TRPM8 constituye un nodo manejable para investigar la regulación del estado celular, la migración y la dinámica de señalización evocada por estímulos dependientes de canales iónicos.

TRPM8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRPM8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRPM8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRPM8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRPM8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRPM8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRPM8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRPM8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRPM8 en células tumorales con expresión de TRPM8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.