Plasmide CRISPR d'Activation (h) Troponin I-SS: sc-403502-ACT

TNNI1 code la troponine I-SS, un isoforme de la troponine I du muscle strié qui constitue la sous-unité inhibitrice du complexe troponine et régule l’interaction actine–myosine de manière dépendante du Ca2+. En modulant l’activation des filaments fins et la contractilité du sarcomère, la troponine I-SS contribue au couplage excitation–contraction et aux performances des fibres musculaires au cours du développement et dans des contextes musculaires spécialisés. L’expression de TNNI1 et l’équilibre entre isoformes s’inscrivent à l’interface de voies contrôlant la myofibrillogenèse, la signalisation calcique et le remodelage de l’appareil contractile. Des modifications de la composition en troponine et une régulation sarcomérique dérégulée sont pertinentes pour l’étude des myopathies et des phénotypes liés aux cardiomyopathies, ainsi que dans des systèmes modèles examinant la différenciation musculaire et les réponses au stress.

Troponin I-SS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNNI1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Troponin I-SS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNNI1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNNI1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Troponin I-SS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNNI1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Troponin I-SS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Troponin I-SS dans les cellules tumorales présentant une expression de TNNI1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.