TRIM72 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403554-ACT

TRIM72 (auch bekannt als MG53) ist eine in Muskelgewebe stark angereicherte E3-Ubiquitin-Ligase mit Tripartite-Motif (TRIM), die die Reparatur der Plasmamembran koordiniert, indem sie Membranschädigungen erkennt und die schnelle Rekrutierung von Vesikeln an Verletzungsstellen fördert. In menschlichen Zellen moduliert TRIM72 die Proteinhomöostase über einen ubiquitinabhängigen Proteinabbau und ist an Stressantwort-Signalwegen beteiligt, die mit Zytoskelett-Umbau und Membrantransport verknüpft sind. Diese Prozesse überschneiden sich mit Signalwegen, die nach zellulärer Schädigung die Integrität von Muskelfasern, den Calciumhaushalt und inflammatorische Signalgebung steuern. Eine fehlregulierte TRIM72-Aktivität wurde mit beeinträchtigter Membranreparatur und Muskelpathologie in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für Studien zu Myopathien, kardiometabolischem Stress und Gewebeschädigungsantworten unterstreicht.

TRIM72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM72-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRIM72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM72-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM72-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRIM72-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM72-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRIM72-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRIM72-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM72-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.