Plásmido CRISPR de Activación (m) TRC8: sc-429220-ACT

Rnf139 codifica TRC8, una ligasa E3 de ubiquitina tipo RING finger residente en el retículo endoplásmico, implicada en el recambio de proteínas dependiente de ubiquitina y en la degradación asociada al RE (ERAD). Al acoplar la ubiquitinación con la eliminación por el proteasoma, TRC8 contribuye a la proteostasis y puede influir en procesos regulados por lípidos y esteroles mediante interacciones con reguladores de señalización y metabólicos anclados a membrana. La alteración de la actividad de TRC8 se ha vinculado con una desregulación del control del crecimiento y de las respuestas al estrés celular, lo que convierte a Rnf139 en un nodo útil para estudiar la señalización por ubiquitina en vías relevantes para la estabilidad del genoma, la homeostasis metabólica y la transformación oncogénica. En modelos murinos, la modulación de la expresión de Rnf139 respalda estudios mecanísticos de la proteostasis específica de tejido y de la reprogramación de la señalización.

TRC8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Rnf139 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRC8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Rnf139 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Rnf139, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRC8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Rnf139 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRC8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRC8 en células tumorales con expresión de Rnf139 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.