TPX2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402581-ACT

TPX2 (proteína de direcionamento para Xklp2) é um fator de montagem do fuso associado aos microtúbulos que coordena a nucleação de microtúbulos independente de centrossomo e estabiliza as fibras do cinetócoro durante a mitose. Atua na via regulada por Ran-GTP/importina para ativar espacialmente a quinase Aurora A e organizar a arquitetura do fuso bipolar, garantindo o alinhamento (congressão) e a segregação corretos dos cromossomos. A expressão desregulada de TPX2 prejudica o controle do checkpoint mitótico, promove instabilidade cromossômica e está frequentemente associada a fenótipos proliferativos observados em diversos contextos tumorais. Por isso, TPX2 é amplamente utilizada como um nó mecanístico para estudar a progressão do ciclo celular, a dinâmica do fuso e a manutenção do genoma em modelos de células humanas.

TPX2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPX2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPX2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPX2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPX2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPX2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPX2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPX2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPX2 em células tumorais com expressão de TPX2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.