TOM40 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400967-ACT

Das humane Gen **TOMM40** kodiert **TOM40**, die zentrale β-Fass-Pore der Translokase des äußeren mitochondrialen Membrankomplexes (TOM), die den Import nukleär kodierter Proteine in die Mitochondrien vermittelt. Durch die Ermöglichung der Erkennung von Vorläuferproteinen und deren Translokation über die äußere Membran unterstützt TOM40 die mitochondriale Proteostase, die Kapazität der oxidativen Phosphorylierung sowie die Abstimmung der mitochondrialen Biogenese mit dem zellulären Stoffwechsel. Die Funktion von TOMM40 überschneidet sich mit Signalwegen, die mitochondriale Dynamik, Stresssignalgebung und Apoptose steuern, da TOM40 eine effiziente Proteinweiterleitung zum Organell aufrechterhält. Genetische Variation und ein dysregulierter mitochondrialer Import wurden mit Neurodegeneration und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch mitochondriale Dysfunktion gekennzeichnet sind, was TOMM40 zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien der mitochondrialen Homöostase macht.

TOM40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOMM40-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TOM40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOMM40-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOMM40-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TOM40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOMM40-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TOM40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TOM40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOMM40-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.