Particules Lentivirales d'Activation (h2) TMEM191B: sc-417493-LAC-2

Le gène humain TMEM191B code la protéine transmembranaire 191B, une protéine membranaire multipasse prédite, probablement localisée dans des compartiments intracellulaires ou à la membrane plasmique, et susceptible de contribuer à l’organisation des membranes ainsi qu’au trafic des protéines. Bien que TMEM191B reste peu caractérisé, des annotations émergentes et des profils d’expression suggèrent un rôle dans la régulation du transport vésiculaire, la dynamique de l’endomembrane et des processus de signalisation cellulaire dépendant de la composition des microdomaines membranaires. Une régulation altérée des réseaux de trafic et de signalisation associés aux membranes est fréquemment impliquée dans le cancer ainsi que dans des phénotypes neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs, ce qui fait de TMEM191B une cible utile pour étudier la sensibilité des voies biologiques aux perturbations de la dose de protéines membranaires. L’édition génomique de TMEM191B permet des études de perte de fonction ou de marquage afin de cartographier sa localisation subcellulaire, d’identifier ses partenaires d’interaction et de définir sa contribution à l’homéostasie cellulaire dans des modèles de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales TMEM191B (h2) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de TMEM191B dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales TMEM191B (h2) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription TMEM191B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de TMEM191B. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif TMEM191B ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.