Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEM106B: sc-404348-ACT

TMEM106B code une protéine transmembranaire lysosomale impliquée dans le trafic endolysosomal, la taille et l’acidification des lysosomes, ainsi que le maintien de la protéostasie cellulaire. Elle s’inscrit dans des voies qui contrôlent la maturation des vésicules et la fonction autophagie–lysosome, influençant le renouvellement des protéines membranaires et l’élimination de cargaisons agrégées au sein du système endosomal. Des études génétiques et d’expression ont associé TMEM106B à la susceptibilité aux maladies neurodégénératives et à des phénotypes de dysfonction lysosomale, notamment à la modulation du risque de démence frontotemporale. En conséquence, TMEM106B est fréquemment étudié dans des modèles neuronaux et gliaux afin d’explorer des mécanismes centrés sur le lysosome qui façonnent la clairance des protéines, les réponses au stress et la survie cellulaire.

TMEM106B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM106B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEM106B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM106B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM106B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEM106B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM106B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEM106B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEM106B dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM106B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.