Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFE3: sc-401179-ACT

TFE3 (facteur de transcription E3) est un facteur de transcription de la famille MiT/TFE, de type hélice-boucle-hélice basique à fermeture éclair leucine (bHLH-LZ), qui se lie aux motifs E-box afin de coordonner des programmes contrôlant la biogenèse des lysosomes, l’autophagie et le métabolisme cellulaire. Il intègre les signaux liés aux nutriments et au stress via des interactions avec une régulation dépendante de mTORC1 et coopère avec des réseaux de gènes lysosomaux pilotés par TFEB/TFE3 pour moduler le trafic vésiculaire et le métabolisme oxydatif. En biologie des maladies humaines, une activité altérée de TFE3 est associée à une protéostasie dérégulée et à des réponses immunitaires innées anormales, et des fusions du gène TFE3 ou sa surexpression sont récurrentes dans certains sous-types de carcinome rénal à cellules claires et d’autres néoplasies. Ces caractéristiques font de TFE3 un nœud utile pour disséquer le contrôle transcriptionnel des voies cataboliques et l’homéostasie des organites.

TFE3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TFE3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFE3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TFE3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TFE3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFE3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TFE3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFE3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFE3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TFE3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.