TF CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420268-ACT

Mouse F3 kodiert den Gewebefaktor (Tissue Factor, TF), ein transmembranäres Glykoprotein, das als primärer Initiator der extrinsischen Gerinnungskaskade fungiert, indem es an Faktor VII/VIIa bindet und die nachgeschaltete Thrombinbildung sowie die Fibrinbildung fördert. Über die Hämostase hinaus kann TF die Gerinnung über proteaseaktivierte Rezeptoren (PAR) mit zellulärer Signalübertragung koppeln und dadurch Entzündung, Gefäßbiologie und Gewebeumbau beeinflussen. Eine fehlregulierte F3/TF-Aktivität ist mit prothrombotischen Zuständen assoziiert und trägt zu pathologischen Prozessen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und entzündlichen Gewebeschäden bei, was TF zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung gerinnungsgekoppelter Signalnetzwerke macht.

TF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen F3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des F3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der F3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native F3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem F3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.