TBX5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423282-ACT

Tbx5 kodiert den T‑Box-Transkriptionsfaktor TBX5, einen sequenzspezifischen DNA-bindenden Regulator, der in der Maus Entwicklungs-Genprogramme koordiniert, die die Bildung der Herzkammern, die Reifung des kardialen Erregungsleitungssystems und die Morphogenese der Vordergliedmaßen steuern. TBX5 wirkt dabei zusammen mit Kofaktoren wie NKX2-5 und GATA4, um Enhancer-Netzwerke und Chromatinzustände zu regulieren, die die Festlegung von Zelllinien und die Gewebemusterung prägen. Seine Aktivität ist in transkriptionelle Kontrollwege integriert, die die Differenzierung von Kardiomyozyten, die elektrische Kopplung und die strukturelle Morphogenese steuern. Veränderte TBX5-Dosierung oder regulatorische Funktion ist mit angeborenen Herz- und Gliedmaßenfehlbildungen verknüpft, was TBX5 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Modellierung von Entwicklungsdysregulation in vivo und in stammzellbasierten Systemen macht.

TBX5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tbx5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBX5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tbx5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tbx5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBX5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tbx5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBX5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBX5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tbx5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.