Plasmide CRISPR d'Activation (h) TAP: sc-402586-ACT

NXF1 humain code TAP, un récepteur central de l’export des ARNm qui couple la transcription et la maturation du pré‑ARNm au transport à travers le pore nucléaire en formant un hétérodimère avec NXT1 et en interagissant avec les nucléoporines via des interactions avec les répétitions FG. TAP se lie à des complexes adaptateurs tels que TREX et reconnaît des caractéristiques des mRNP afin de favoriser un export nucléaire efficace, influençant ainsi l’expression génique globale, la surveillance des ARN et le couplage entre épissage et export. Par son rôle dans la régulation de la composition des ARNm et de leur disponibilité cytoplasmique, NXF1/TAP affecte des voies telles que le métabolisme des ARN, le contrôle de la traduction et des programmes d’expression génique répondant au stress. La dérégulation de la machinerie d’export des ARNm a été associée à des perturbations de l’homéostasie du transcriptome observées dans des contextes de cancer et de maladies neurodégénératives, faisant de NXF1 une cible pertinente pour des études mécanistiques sur le transport des ARN et la fidélité de l’expression génique.

TAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NXF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NXF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NXF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NXF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TAP dans les cellules tumorales présentant une expression de NXF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.