Su[fu] CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401599-ACT

SUFU (Suppressor of Fused) kodiert das menschliche Su[fu]-Protein, einen zentralen negativen Regulator des Hedgehog-Signalwegs, der GLI-Transkriptionsfaktoren hemmt und dazu beiträgt, während der Entwicklung und der Gewebehomöostase eine angemessene Signalwegaktivität aufrechtzuerhalten. Durch die Modulation der GLI-Prozessierung, der nukleären Lokalisation und der transkriptionellen Aktivität ist SUFU in primärzilienabhängige Signalübertragung sowie in übergeordnete Netzwerke der Transkriptionskontrolle eingebunden. Eine Fehlregulation von SUFU oder nachgeschalteten Komponenten des Hedgehog-Signalwegs wird mit aberranten proliferativen Signalen und einer veränderten Festlegung von Zellschicksalen in Verbindung gebracht, weshalb SUFU häufig als Knotenpunkt beim „Rewiring“ des Signalwegs untersucht wird. Die SUFU-Funktion ist zudem relevant für Untersuchungen zur Stamm-/Vorläuferzellbiologie, zu Ziliopathien und zu onkogenen Signalkontexten, in denen die GLI-abhängige Transkription gestört ist.

Su[fu] Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SUFU-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Su[fu] Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SUFU-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SUFU-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Su[fu]-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SUFU-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Su[fu]-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Su[fu]-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SUFU-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.