Stim1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401311-ACT

STIM1 kodiert das stromale Interaktionsmolekül 1 (Stim1), einen Ca2+-Sensor des endoplasmatischen Retikulums, der den store-operated calcium entry (SOCE) auslöst, indem er die Entleerung der ER-Calciumspeicher mit der Aktivierung von ORAI-Kanälen an Kontaktstellen zwischen ER und Plasmamembran koppelt. Diese Calciumsignalkaskade koordiniert zytosolische Ca2+-Oszillationen, die Transkriptionsprogramme, Zytoskelett-Remodelling, Sekretion und den Fortschritt des Zellzyklus regulieren, unter anderem über Signalwege wie Calcineurin–NFAT und MAPK. STIM1-abhängiger SOCE ist ein zentraler Determinant der Aktivierung von Immunzellen und der allgemeinen Calciumhomöostase in vielen Geweben. Eine dysregulierte STIM1-Aktivität und veränderte Dynamiken des Ca2+-Einstroms wurden mit veränderter inflammatorischer Signalgebung, neuromuskulärer Funktion sowie krebsrelevanten Phänotypen wie Migration und metabolischer Anpassung in Verbindung gebracht, was STIM1 als mechanistischen Knotenpunkt für Krankheitsmodelle nahelegt.

Stim1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STIM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Stim1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STIM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STIM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Stim1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STIM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Stim1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Stim1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STIM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.