Plasmide CRISPR d'Activation (h) SRC-1: sc-400879-ACT

NCOA1 code pour le coactivateur 1 des récepteurs stéroïdiens (SRC-1), un coactivateur transcriptionnel qui intègre la signalisation dépendante des ligands provenant des récepteurs nucléaires et d’autres facteurs de transcription afin de moduler l’accessibilité de la chromatine et l’expression génique dirigée par l’ARN polymérase II. SRC-1 recrute des histone-acétyltransférases ainsi que d’autres corégulateurs pour coordonner des programmes impliqués dans la transcription répondant aux hormones, l’homéostasie métabolique, le contrôle du cycle cellulaire et la différenciation développementale. Grâce au dialogue croisé avec les voies dépendantes du récepteur des œstrogènes, du récepteur des androgènes, du récepteur des glucocorticoïdes et des facteurs de croissance, SRC-1 contribue à un remodelage transcriptionnel dépendant du contexte. Des altérations de l’expression de NCOA1/SRC-1 ou de l’activité du coactivateur ont été associées à une dérégulation de la signalisation endocrinienne et des réseaux transcriptionnels observée dans la biologie des maladies liées aux hormones, offrant un point d’entrée mécanistique pour étudier la régulation génique spécifique des voies.

SRC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCOA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SRC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCOA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCOA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SRC-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCOA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SRC-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SRC-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NCOA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.