SPRED2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431133-ACT

Spred2 codifica SPRED2, una proteina adattatrice correlata a Sprouty che regola negativamente la segnalazione delle tirosin-chinasi recettoriali limitando la cascata RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. Attraverso interazioni con RAF e con complessi di segnalazione associati, SPRED2 contribuisce a modulare gli output indotti dai fattori di crescita, quali proliferazione, differenziamento, migrazione ed espressione di geni infiammatori. Nei modelli murini, un’alterata attività di SPRED2 è stata collegata a una deregolazione delle dinamiche di segnalazione MAPK e a conseguenti cambiamenti a valle nell’omeostasi immunitaria e tissutale. In quanto “freno” della via, SPRED2 è spesso studiata in contesti in cui ampiezza e durata della segnalazione ERK influenzano fenotipi rilevanti per modelli di trasformazione oncogenica, biologia vascolare e patologie associate all’infiammazione.

SPRED2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Spred2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPRED2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Spred2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Spred2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPRED2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Spred2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPRED2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPRED2 nelle cellule tumorali con espressione di Spred2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.