Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPAG17: sc-410482-ACT

SPAG17 (antigène associé aux spermatozoïdes 17) code une protéine d’échafaudage associée aux microtubules, nécessaire à une architecture axonémale correcte et au bon fonctionnement des cils motiles. Elle contribue à l’assemblage et à la stabilité du complexe de la paire centrale ainsi qu’aux interactions avec les rayons radiaires qui coordonnent le battement entraîné par les dynéines, reliant ainsi SPAG17 à l’organisation du cytosquelette et aux voies de la ciliogenèse. En biologie humaine, une expression ou une fonction altérée de SPAG17 est associée à des défauts de motilité ciliaire pouvant affecter la biologie de la reproduction et d’autres tissus dépendants des cils. En tant que facteur régulateur des cils/flagelles, SPAG17 constitue un gène marqueur utile pour étudier les programmes transcriptionnels qui gouvernent la motilité, la différenciation et la dynamique des microtubules.

SPAG17 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPAG17 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPAG17 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPAG17 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPAG17, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPAG17. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPAG17 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPAG17 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPAG17 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPAG17 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.