SP140 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-436685-ACT

Das murine Sp140 kodiert für SP140, einen nukleären Chromatin-Reader, der in Immunzelllinien besonders stark exprimiert ist und zur Ausprägung transkriptioneller Programme während angeborener und adaptiver Immunantworten beiträgt. SP140 enthält epigenetische „Reader“-Module, die mit modifizierten Histonen interagieren und so die Chromatinzugänglichkeit beeinflussen; damit ist es mit Signalwegen verknüpft, die die Zytokin-Signalübertragung, die Expression interferon-stimulierter Gene sowie die Repression bzw. Aktivierung entzündungsbezogener Gene steuern. Durch die Modulation der Transkription an immunrelevanten Loci wird SP140 zur Untersuchung der Differenzierung von Makrophagen und B-Zellen, antimikrobieller Antworten und der epigenetischen Regulation entzündlicher Netzwerke eingesetzt. Eine veränderte SP140-Aktivität wurde mit einer dysregulierten Immunhomöostase und der Biologie entzündlicher Erkrankungen in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Immunogenetik und der chromatingesteuerten Genregulation macht.

SP140 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sp140-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SP140 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sp140-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sp140-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SP140-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sp140-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SP140-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SP140-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sp140-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.