SmcX CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423030-ACT

Kdm5c (SmcX) kodiert eine X-chromosomal lokalisierte Histon-Demethylase mit Jumonji‑C‑(JmjC)-Domäne, die H3K4me2/3-Markierungen entfernt und dadurch während der Entwicklung die Chromatinzugänglichkeit sowie Transkriptionsprogramme formt. In Mauszellen moduliert SmcX die epigenetische Kontrolle der Genexpression, die mit neuronaler Differenzierung, synaptischer Funktion und aktivitätsabhängiger Transkription verknüpft ist, und wirkt dabei mit Signalwegen zusammen, die Zellschicksalsentscheidungen sowie genomweite Promotor-/Enhancer-Zustände regulieren. Eine Störung oder Fehlregulation von KDM5C ist mit neurodevelopmentalen Phänotypen und veränderter kognitiver Funktion assoziiert, was mit seiner Rolle bei der Aufrechterhaltung einer angemessenen transkriptionellen Homöostase übereinstimmt. SmcX ist daher ein nützliches Ziel zur Untersuchung der chromatingesteuerten Regulation, neuronaler Gennetzwerke und epigenetischer Beiträge zu krankheitsrelevanten zellulären Zuständen.

SmcX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Kdm5c-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SmcX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Kdm5c-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Kdm5c-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SmcX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Kdm5c-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SmcX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SmcX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Kdm5c-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.