SLC12A9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408925-ACT

SLC12A9 kodiert ein Mitglied der Solute-Carrier-Familie 12 der kationen-/chloridtransportassoziierten Proteine. Es ist an der Regulation der Ionenhomöostase über intrazelluläre Membranen beteiligt und beeinflusst das osmotische Gleichgewicht, den pH-Wert sowie die Kontrolle des Zellvolumens. Durch seine Effekte auf den Umgang mit Chlorid und Alkali-Kationen kann SLC12A9 das Membranpotenzial und Signalwege beeinflussen, die mit Stressanpassung und Organellenfunktion gekoppelt sind. Veränderte Expression oder dysregulierte Ionentransportprozesse werden häufig mit epithelialer und neuronaler Physiologie in Verbindung gebracht und sind darüber hinaus relevant für Erkrankungen, bei denen das Elektrolytgleichgewicht und die zelluläre Volumenkontrolle gestört sind. Daher ist SLC12A9 für mechanistische Studien interessant, die Ionentransportnetzwerke mit der Regulation von Zellzuständen in humanen Systemen verknüpfen.

SLC12A9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC12A9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SLC12A9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC12A9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC12A9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SLC12A9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC12A9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SLC12A9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SLC12A9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC12A9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.