SIM2s CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405609-ACT

Das humane SIM2 (single-minded family bHLH transcription factor 2) kodiert mehrere Isoformen, darunter SIM2s, einen Transkriptionsregulator mit basischem Helix-Loop-Helix-(bHLH)- und PAS-Domäne, der mit ARNT Heterodimere bildet und an CNS-Mittellinien-Enhancer-ähnliche Elemente bindet, um Genexpressionsprogramme zu modulieren. SIM2s trägt zur Festlegung von Zelllinien und zur Differenzierung bei und beeinflusst Transkriptionsnetzwerke, die mit Entwicklung, epithelialer Identität und zellulärer Homöostase verknüpft sind. Eine veränderte SIM2/SIM2s-Expression wurde in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten beschrieben, darunter solide Tumoren und neuroentwicklungsbezogene Phänotypen, wo sie mit hypoxieabhängigen, Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor-assoziierten und allgemeineren transkriptionellen Kontrollwegen zusammenwirken kann. Diese Eigenschaften machen SIM2s zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung kontextabhängiger Transkriptionsregulation und nachgeschalteter Umgestaltung von Signalwegen.

SIM2s Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIM2s Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIM2s-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIM2s-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIM2s-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.