Serpinb3a CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422808-ACT

Mouse Serpinb3a kodiert einen Serinprotease-Inhibitor (Serpin) der Klasse B, der an der Regulation der intrazellulären Proteaseaktivität, zellulären Stressantworten und der Homöostase von Epithelgewebe beteiligt ist. Als intrazellulärer Serpin kann Serpinb3a proteaseabhängige Prozesse beeinflussen, die mit Entzündung, Gewebeumbau und Barriereintegrität verknüpft sind, und dabei mit Signalwegen zusammenwirken, die Apoptose, Anpassung an oxidativen Stress und Immun-Signaling modulieren. Eine veränderte Expression von Mitgliedern der Serpin-Familie wurde mit dysregulierten inflammatorischen Mikroumgebungen und Phänotypen epithelialer Schädigung in Verbindung gebracht, wodurch Serpinb3a einen nützlichen molekularen Knotenpunkt für die Untersuchung kontextabhängiger Stress- und Proteostase-Programme darstellt. In Mausmodellen werden die Expressionsdynamiken von Serpinb3a häufig in Studien zu Gewebeschädigung, fibrotischem Umbau und immunvermittelter Pathologie untersucht, bei denen das Protease–Antiprotease-Gleichgewicht ein zentraler Determinant zellulärer Outcomes ist.

Serpinb3a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Serpinb3a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Serpinb3a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Serpinb3a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Serpinb3a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Serpinb3a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Serpinb3a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Serpinb3a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Serpinb3a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Serpinb3a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.