SCG10 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422814-ACT

Stmn2 kodiert SCG10, ein in Neuronen angereichertes Phosphoprotein aus der Stathmin-Familie, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert, indem es an Tubulin bindet und die Destabilisierung von Mikrotubuli während der Neuritinitiation, des Axonwachstums und des Umbaus des Wachstumskegels in Mauszellen fördert. SCG10 wird in Neuriten und Wachstumskegel transportiert und verknüpft damit die Umgestaltung des Zytoskeletts mit intrazellulärem Transport sowie aktivitätsabhängiger neuronaler Plastizität. Über seine Kontrolle des Mikrotubuli-Umsatzes beeinflusst SCG10 Prozesse wie axonale Regeneration, synaptische Konnektivität und Programme der neuronalen Differenzierung. Eine veränderte Regulation von STMN2/SCG10 wird häufig im Zusammenhang mit Neurodegeneration und Axonopathien untersucht, einschließlich Signalwegen, die mit der Vulnerabilität von Motoneuronen und einer beeinträchtigten axonalen Aufrechterhaltung in Verbindung gebracht werden.

SCG10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Stmn2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SCG10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Stmn2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Stmn2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SCG10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Stmn2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SCG10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SCG10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Stmn2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.