SCAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401474-ACT

Humanes SCAP (SREBF-Chaperon) ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das als Sterolsensor und Escort-Faktor für SREBP-Transkriptionsfaktoren fungiert und deren regulierten Transport zum Golgi-Apparat zur proteolytischen Aktivierung ermöglicht. Über diese SCAP–SREBP-Achse steuert SCAP Transkriptionsprogramme, die die Cholesterin- und Fettsäurebiosynthese, die Homöostase von Membranlipiden sowie adaptive Antworten auf die Nährstoff- und Sterolverfügbarkeit regulieren. Die SCAP-Aktivität ist in INSIG-vermittelte Retention, den Transport vom ER zum Golgi und die Feedback-Regulation der Expression lipogener Gene eingebunden. Eine Fehlregulation der SCAP-abhängigen Signalübertragung wurde mit verändertem Lipidstoffwechsel bei Stoffwechselerkrankungen sowie mit einer Lipid-Reprogrammierung in Verbindung gebracht, die in verschiedenen Krebsarten Wachstum und Stressanpassung unterstützt.

SCAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SCAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SCAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SCAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SCAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SCAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SCAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SCAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SCAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SCAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.