RPGRIP1L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404458-ACT

RPGRIP1L kodiert ein Protein der Übergangszone der Zilie, das als Gerüst für RPGR‑interagierende Komponenten dient und zur Ausbildung der Diffusionsbarriere beiträgt, welche den Proteintransport in die und aus der primären Zilie reguliert. Es ist an der Organisation von Zentrosom/Basalkörper beteiligt und unterstützt Hedgehog‑ sowie weitere zilienabhängige Signalwege, die die embryonale Musterbildung und die Gewebehomöostase koordinieren. Eine Störung von RPGRIP1L beeinträchtigt die Ziliogenese und die Signaltransduktion und verknüpft veränderte „ciliary gating“-Mechanismen mit pleiotropen Entwicklungsphänotypen. Genetische Varianten in RPGRIP1L wurden mit Ziliopathien, einschließlich Erkrankungen aus dem Joubert‑ und Meckel‑Spektrum, in Verbindung gebracht, was RPGRIP1L zu einem nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung ziliär getriebener Krankheitsmechanismen in menschlichen Zellen macht.

RPGRIP1L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPGRIP1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPGRIP1L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPGRIP1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPGRIP1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPGRIP1L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPGRIP1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPGRIP1L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPGRIP1L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPGRIP1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.