RNF181 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403952-ACT

RNF181 kodiert eine RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Ubiquitinierung von Substraten fördert und dadurch den Proteinumsatz sowie die Signalausgabe reguliert. Durch die ubiquitinabhängige Modulation zentraler Signalintermediate ist RNF181 an der Steuerung von Immun- und Entzündungsreaktionen, der Anpassung an zellulären Stress und der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase beteiligt. Eine veränderte Expression oder Aktivität von RNF181 kann die Stärke und zeitliche Dynamik von Signalwegen stören, was seine Regulation mit Mechanismen verknüpft, die für onkogene Signalgebung, Immunfehlfunktionen und andere Zustände relevant sind, in denen die Ubiquitin-Signalübertragung dysreguliert ist. Diese Eigenschaften machen RNF181 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um die ubiquitinvermittelte Kontrolle von Signalwegen und Veränderungen des transkriptionellen Zustands in menschlichen Zellmodellen zu untersuchen.

RNF181 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF181-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNF181 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF181-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF181-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNF181-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF181-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNF181-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNF181-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF181-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.