rapsyn CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403991-ACT

Das humane Gen **RAPSN** kodiert Rapsyn, ein postsynaptisches Gerüstprotein, das für die Clusterung und Stabilisierung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (AChRs) an der neuromuskulären Endplatte essenziell ist. Rapsyn koordiniert Protein-Protein-Interaktionen, die die postsynaptische Membran organisieren, und unterstützt die Synapsenreifung durch Verankerung der Rezeptoren und Anbindung an das Zytoskelett. Die RAPSN-Funktion überschneidet sich mit der Agrin–LRP4–MuSK-Signalkaskade und nachgeschalteten Assemblierungsprozessen, die eine effiziente neuromuskuläre Signalübertragung aufrechterhalten. Eine gestörte RAPSN-Aktivität oder -Expression wird mit kongenitalen myasthenischen Syndromen und verwandten Erkrankungen der neuromuskulären Endplatte in Verbindung gebracht, was RAPSN zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der synaptischen Organisation macht.

rapsyn Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAPSN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

rapsyn Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAPSN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAPSN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen rapsyn-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAPSN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von rapsyn-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des rapsyn-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAPSN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.