Plásmido CRISPR de Activación (h) RANK: sc-400559-ACT

TNFRSF11A codifica RANK, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que funciona como un nodo clave de señalización en el control, impulsado por RANKL, de la diferenciación, activación y supervivencia de los osteoclastos. Tras la unión del ligando, RANK recluta proteínas adaptadoras como las TRAF para iniciar la señalización canónica y no canónica de NF-κB, cascadas de MAPK y programas transcripcionales dependientes de AP-1/NFATc1. Estas vías integran señales del microambiente óseo y del sistema inmunitario, vinculando la actividad de RANK con la osteoinmunología y la regulación de la expresión génica inflamatoria. La señalización desregulada de RANK se ha asociado con fenotipos anómalos de remodelación ósea y con una función alterada de las células inmunitarias, lo que convierte a TNFRSF11A en un blanco ampliamente utilizado para estudios mecanísticos de biología esquelética e inflamatoria.

RANK El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TNFRSF11A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RANK El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TNFRSF11A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TNFRSF11A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RANK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TNFRSF11A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RANK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RANK en células tumorales con expresión de TNFRSF11A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.