Plásmido CRISPR de Activación (h) Ral A: sc-403983-ACT

RALA codifica la pequeña GTPasa RalA, un interruptor molecular de tipo Ras que alterna entre estados unidos a GDP y a GTP para coordinar el tráfico vesicular, la exocitosis y la remodelación del citoesqueleto de actina. A través de la señalización dependiente de RalGEF, RalA interactúa con efectores como el complejo exocisto y RalBP1 para regular la dinámica de membrana, el reciclaje de receptores y la polaridad celular. La actividad de RalA se integra con redes asociadas a Ras/MAPK y PI3K, conectando señales de factores de crecimiento con cambios en la migración, la adhesión y la proliferación. La desregulación de la señalización de RalA se ha asociado con comportamiento invasivo alterado y con cambios en la salida de vías oncogénicas en múltiples contextos de cáncer, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar la especificidad de las ramas efectoras de Ras y los fenotipos de tráfico de membrana.

Ral A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RALA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ral A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RALA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RALA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ral A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RALA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ral A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ral A en células tumorales con expresión de RALA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.