Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ral A: sc-403983-ACT

RALA code la petite GTPase RalA, un commutateur moléculaire de type Ras qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de coordonner le trafic vésiculaire, l’exocytose et le remodelage du cytosquelette d’actine. Via une signalisation dépendante des RalGEF, RalA engage des effecteurs tels que le complexe exocyste et RalBP1 pour réguler la dynamique membranaire, le recyclage des récepteurs et la polarité cellulaire. L’activité de RalA s’intègre aux réseaux associés à Ras/MAPK et à PI3K, reliant les signaux des facteurs de croissance à des changements de migration, d’adhérence et de prolifération. Une signalisation RalA dérégulée a été associée à des modifications du comportement invasif et de la sortie des voies oncogéniques dans de multiples contextes cancéreux, ce qui en fait un nœud utile pour étudier la spécificité des branches effectrices de Ras et les phénotypes de trafic membranaire.

Ral A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RALA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ral A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RALA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RALA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ral A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RALA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ral A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ral A dans les cellules tumorales présentant une expression de RALA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.