Rac 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422573-ACT

Rac1 kodiert Rac1, eine kleine GTPase der Rho-Familie, die zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt, um den Umbau des Aktinzytoskeletts, die Bildung von Lamellipodien und die Zellpolarität zu koordinieren. In Mauszellen integriert RAC1 Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen, Integrinen und Chemokinrezeptoren, um Signalwege zu regulieren, an denen PAK, PI3K/AKT, MAPK sowie die WAVE/ARP2/3-abhängige Aktinnukleation beteiligt sind. Diese Prozesse beeinflussen die Dynamik der Zelladhäsion, den Vesikeltransport und die Signalgebung reaktiver Sauerstoffspezies über NADPH-Oxidase-Komplexe. Eine fehlregulierte RAC1-Aktivität wurde mit veränderten Migrations- und Invasionsphänotypen, aberranter Entwicklungssignalgebung und Tumorbiologie in Verbindung gebracht und macht RAC1 zu einem zentralen Knotenpunkt in mechanistischen Studien zur Kontrolle des Zytoskeletts und zur Signaltransduktion.

Rac 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rac1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rac 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rac1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rac1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rac 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rac1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rac 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rac 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rac1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.