R1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401712-ACT

Humanes RRM1 kodiert die katalytische R1‑Untereinheit der Ribonukleotidreduktase, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für die de‑novo‑Synthese von Desoxyribonukleotiden, die für DNA‑Replikation und ‑Reparatur erforderlich ist. R1 bildet mit RRM2 oder RRM2B ein Enzymkomplex, um ausgewogene dNTP‑Pools aufrechtzuerhalten, und verknüpft damit den Nukleotidstoffwechsel mit dem Fortschreiten der S‑Phase, Antworten auf Replikationsstress und Signalwegen der Genomstabilität. Eine fehlregulierte RRM1‑Aktivität kann die Toleranz gegenüber DNA‑Schäden und die Mutationslast verändern und ist daher relevant für Studien zu proliferativen Signalwegen, chemogenomischen Antwortsignaturen sowie Mechanismen der Genomerhaltung bei Krebs und anderen Erkrankungen, die durch Replikationsstress gekennzeichnet sind.

R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RRM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RRM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RRM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen R1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RRM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von R1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des R1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RRM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.