PYGL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401950-ACT

Das humane PYGL-Gen kodiert die Leber-Isoform der Glykogenphosphorylase, ein zentrales zytosolisches Enzym, das die phosphorolytische Spaltung von Glykogen katalysiert und dabei Glukose-1-phosphat für die nachgeschaltete Glykolyse sowie die Aufrechterhaltung der systemischen Glukosehomöostase bereitstellt. Die PYGL-Aktivität verknüpft hormonelle und nährstoffabhängige Signale mit der Glykogenolyse und dem umfassenderen Kohlenhydratstoffwechsel und trägt so zur zellulären Energiebalance bei Fasten und metabolischem Stress bei. Eine Fehlregulation des hepatischen Glykogenabbaus ist mit angeborenen Störungen des Glykogenstoffwechsels assoziiert und kann metabolische Phänotypen beeinflussen, die mit Insulinresistenz und der Leberfunktion zusammenhängen. Als Knotenpunkt, der die Glykogenspeicherung mit dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel verbindet, wird PYGL in der Leberbiologie, der Regulation metabolischer Flüsse und in energie-sensitiven Signalnetzwerken umfassend untersucht.

PYGL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PYGL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PYGL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PYGL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PYGL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PYGL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PYGL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PYGL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PYGL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PYGL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.