PTRF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404669-ACT

Il gene umano CAVIN1 (PTRF) codifica il polymerase I and transcript release factor, un componente fondamentale della famiglia delle cavin, necessario per la biogenesi delle caveole e la loro stabilizzazione sulla membrana plasmatica. PTRF coordina la curvatura di membrana dipendente dalle caveoline, la meccanoprotezione e l’endocitosi mediata dalle caveole, influenzando la compartimentalizzazione dei segnali e l’omeostasi lipidica. Attraverso il suo ruolo nell’organizzazione dei microdomini di membrana, PTRF modula vie legate alla segnalazione dell’insulina, alla differenziazione degli adipociti e alla dinamica del citoscheletro. Alterazioni della funzione o dell’espressione di CAVIN1/PTRF sono state associate a fenotipi correlati alla lipodistrofia, ad anomalie muscolari e a una deregolazione della segnalazione cellulare rilevante per la biologia del cancro e la ricerca sulle malattie metaboliche.

PTRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAVIN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAVIN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAVIN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTRF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAVIN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTRF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTRF nelle cellule tumorali con espressione di CAVIN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.