PPP1R15B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408988-ACT

PPP1R15B (auch als CReP bekannt) kodiert eine regulatorische Untereinheit, die Proteinphosphatase 1 (PP1) gezielt zur Dephosphorylierung von eIF2α rekrutiert und damit als zentraler Gegenspieler der stressinduzierten Repression der Translation wirkt. Durch die Förderung der eIF2α-Dephosphorylierung trägt PPP1R15B dazu bei, nach Störungen die globale Proteinsynthese wiederherzustellen, und moduliert Signale der integrierten Stressantwort (ISR), die mit ER-Stress, Proteostase und Programmen des Zellüberlebens verknüpft sind. Diese PP1-gerichtete Kontrolle beeinflusst nachgeschaltete transkriptionelle und metabolische Anpassungswege, die durch ATF4/CHOP-abhängige Netzwerke gesteuert werden. Eine Fehlregulation der Phosphorylierungsdynamik von eIF2α und der Feinabstimmung der ISR wurde in unterschiedlichen Kontexten beschrieben, darunter Neurodegeneration, metabolischer Stress und die Anpassung von Krebszellen, wodurch PPP1R15B einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Stressresilienz darstellt.

PPP1R15B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R15B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PPP1R15B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R15B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R15B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PPP1R15B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R15B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PPP1R15B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PPP1R15B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R15B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.