Plasmide CRISPR d'Activation (h) PME-1: sc-402446-ACT

Le gène humain **PPME1** code la protéine **méthylestérase de la phosphatase 1 (PME‑1)**, une enzyme qui hydrolyse l’ester méthylique en C‑terminal des sous-unités catalytiques de **PP2A** et module ainsi l’assemblage de l’holoenzyme PP2A, sa localisation et la sélection de ses substrats. En régulant l’état de méthylation de PP2A, PME‑1 influence le contrôle, dépendant de la phosphorylation, de la progression du cycle cellulaire, de la signalisation des dommages à l’ADN et des voies de réponse au stress, notamment les sorties des réseaux **MAPK** et **PI3K/AKT**. Une régulation altérée de PP2A est largement pertinente pour les mécanismes de signalisation kinase aberrante et de protéostase, fréquemment étudiés en biologie du cancer et dans la neurodégénérescence. **PPME1** constitue donc un nœud utile pour analyser comment un réglage fin des phosphatases remodèle la dynamique des signaux et les phénotypes cellulaires dans des conditions physiologiques et associées aux maladies.

PME-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPME1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PME-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPME1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPME1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PME-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPME1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PME-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PME-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPME1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.