PLIC-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404783-ACT

Das humane UBQLN2-Gen kodiert das ubiquitinähnliche Protein PLIC-2, einen Ubiquitinrezeptor und Adapter, der polyubiquitinierte Substrate an das 26S-Proteasom koppelt und so die Proteostase aufrechterhält. PLIC-2 ist an der ubiquitinabhängigen Proteinkontrolle, der ER-assoziierten Degradation (ERAD) sowie am Abbau fehlgefalteter oder aggregationsanfälliger Proteine beteiligt und steht damit in Verbindung mit zellulären Stressantworten und dem Crosstalk zwischen Autophagie und Proteasom. Eine dysregulierte UBQLN2-Funktion wurde mit aberranter Proteinaggregation und beeinträchtigten Clearance-Mechanismen in Zusammenhang gebracht, die für Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen relevant sind, darunter ALS und Pathologien aus dem Spektrum der frontotemporalen Demenz. Als Knotenpunkt in der Ubiquitin-Proteasom-Signalgebung wird UBQLN2 häufig hinsichtlich seiner Rolle in der neuronalen Homöostase, der Bildung zytoplasmatischer Einschlüsse und der Modulation proteotoxischer Stresswege untersucht.

PLIC-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBQLN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PLIC-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBQLN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBQLN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PLIC-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBQLN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PLIC-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PLIC-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBQLN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.