PLAP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400629-ACT

ALPP codifica a fosfatase alcalina placentária (PLAP), uma ectoenzima ancorada por glicosilfosfatidilinositol (GPI) que desfosforila substratos extracelulares e contribui para a homeostase do fosfato na superfície celular. A atividade da PLAP está associada à organização de microdomínios de membrana, à modulação da sinalização purinérgica por meio da desfosforilação de nucleotídeos e ao controle mais amplo do metabolismo de fosfomonoésteres extracelulares. Em tecidos humanos, ALPP é mais proeminente na placenta e é frequentemente usado como marcador associado à diferenciação na biologia de trofoblastos e em contextos relacionados a células germinativas. A expressão desregulada de ALPP/PLAP foi relatada em diversos cenários relevantes para doenças, sustentando sua utilidade para estudar programas de linhagem, a função de enzimas de superfície celular e estados de expressão associados a tumores em modelos experimentais.

PLAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALPP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PLAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALPP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALPP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PLAP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALPP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PLAP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PLAP em células tumorais com expressão de ALPP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.