Plasmide CRISPR d'Activation (h) plakophilin 3: sc-403614-ACT

PKP3 code la plakophiline 3, une protéine à répétitions armadillo qui se localise aux desmosomes et soutient l’adhésion cellule–cellule des épithéliums en stabilisant les complexes cadhérine desmosomale–plakoglobine et en reliant les assemblages jonctionnels aux filaments intermédiaires. En régulant l’assemblage des desmosomes et le remodelage des jonctions, la plakophiline 3 contribue à l’intégrité tissulaire, à la polarité et aux voies de mécanotransduction qui coordonnent l’organisation du cytosquelette. Une expression altérée de PKP3 ou une dysfonction des desmosomes a été associée à des défauts de barrière épithéliale et à des phénotypes liés au cancer, notamment des modifications des programmes de migration et d’invasion. Ces propriétés font de PKP3 un nœud utile pour étudier la biologie des jonctions, la signalisation du cytosquelette et des réponses transcriptionnelles dépendantes du contexte aux signaux d’adhésion.

plakophilin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PKP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

plakophilin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PKP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PKP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de plakophilin 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PKP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de plakophilin 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie plakophilin 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PKP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.