PKAβ cat CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400649-ACT

PRKACB kodiert die katalytische Beta-Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKAβcat), eine zentrale Serin/Threonin-Kinase, die cAMP-Signale in Phosphorylierungsprogramme übersetzt, welche Stoffwechsel, Transkription, Zellzyklusprogression und synaptische Plastizität steuern. Bei einer GPCR-vermittelten Erhöhung von cAMP dissoziieren die katalytischen PKA-Untereinheiten von den regulatorischen Untereinheiten, um Substrate wie CREB und weitere Effektorproteine des Signalwegs zu phosphorylieren und dabei Signale über MAPK/ERK, die Regulation von Ionenkanälen und die mitochondriale Dynamik zu integrieren. Die Aktivität von PRKACB beeinflusst die zelluläre Differenzierung und Stressantworten, und eine veränderte cAMP–PKA-Signalgebung wurde in mehreren Krankheitskontexten mit einer dysregulierten Wachstumskontrolle und neurobiologischen Phänotypen in Verbindung gebracht. Als zentraler Knotenpunkt der cAMP-Signalgebung wird PRKACB häufig untersucht, um die Verschaltung des Signalwegs, Feedback-Regulation und phosphorylierungsabhängige transkriptionelle Outputs in menschlichen Zellen zu analysieren.

PKAβ cat Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKACB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKAβ cat Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKACB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKACB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKAβ cat-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKACB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKAβ cat-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKAβ cat-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKACB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.