Pitx3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402995-ACT

PITX3 kodiert den paired-like Homeodomänen-Transkriptionsfaktor Pitx3, einen nukleären Regulator, der dazu beiträgt, die Identität dopaminerger Neuronen des Mittelhirns festzulegen, und der die neuronale Differenzierung sowie den Erhalt dieser Zellen unterstützt. Pitx3 wirkt innerhalb entwicklungsbiologischer Transkriptionsnetzwerke, die mit der Wnt/β-Catenin-Signalgebung, retinsäureabhängigen Programmen und weiteren Homeobox-Faktoren verknüpft sind und so Zellschicksalsentscheidungen und Reifungszustände mitgestalten. Eine veränderte Regulation von PITX3 wurde mit einer erhöhten Vulnerabilität des dopaminergen Systems in Verbindung gebracht und wird im Kontext der Neuroentwicklungs- und Neurodegenerationsbiologie untersucht, einschließlich Signalwegen, die für Morbus Parkinson relevant sind. Als transkriptioneller Steuerfaktor wird Pitx3 zudem genutzt, um genregulatorische Schaltkreise, Übergänge von Chromatinzuständen und Zellschicksals-Reprogrammierung in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

Pitx3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PITX3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pitx3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PITX3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PITX3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pitx3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PITX3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pitx3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pitx3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PITX3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.