PITHD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412754-ACT

Humanes PITHD1 (auch als SOPD1 bekannt) kodiert einen kleinen, proteasomassoziierten Faktor, der zur Proteom-Qualitätskontrolle beiträgt, indem er den Abbau ubiquitinmarkierter Substrate fördert. Es wurde mit der Regulation der Proteasomfunktion und zellulären Proteostase‑Signalwegen in Verbindung gebracht, die Stressantworten und den Umsatz kurzlebiger regulatorischer Proteine prägen. Durch seine Rolle im Ubiquitin‑Proteasom‑System ist PITHD1 relevant für Studien zur Transkriptionskontrolle, zum Fortschreiten des Zellzyklus und zur Anpassung an proteotoxischen Stress. Eine gestörte Proteostase ist ein häufiges Merkmal in der Krebs- und Neurodegenerationsforschung, wodurch PITHD1 ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen proteasomabhängiger Phänotypen ist.

PITHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PITHD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PITHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PITHD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PITHD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PITHD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PITHD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PITHD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PITHD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PITHD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.