Plásmido CRISPR de Activación (h) PiT1: sc-403121-ACT

SLC20A1 codifica PiT1 (SLC20A1), un transportador de fosfato inorgánico (Pi) dependiente de sodio en la membrana plasmática que favorece la captación de fosfato necesaria para la síntesis de nucleótidos, el metabolismo de fosfolípidos y la bioenergética dependiente de ATP. Más allá del transporte, PiT1 contribuye al control del crecimiento celular y a la detección de nutrientes, conectando la disponibilidad extracelular de fosfato con programas metabólicos intracelulares y la progresión del ciclo celular. La expresión alterada de SLC20A1 se ha estudiado en contextos de homeostasis del fosfato desregulada, proliferación aberrante y respuestas al estrés, donde el flujo de Pi puede influir en redes de señalización y procesos relacionados con la calcificación. Como transportador humano de expresión amplia, PiT1 es un nodo útil para estudiar la regulación del metabolismo y la expresión génica dependiente del fosfato en diversos tipos celulares.

PiT1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC20A1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PiT1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC20A1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC20A1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PiT1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC20A1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PiT1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PiT1 en células tumorales con expresión de SLC20A1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.