Pin1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400485-ACT

PIN1 kodiert die Peptidyl‑Prolyl‑cis/trans‑Isomerase NIMA‑interacting 1 (Pin1), eine phosphorylierungsabhängige Prolyl‑Isomerase, die Ser/Thr‑Pro‑Motive erkennt und Zielproteine nach der Phosphorylierung strukturell umformt. Indem Pin1 Konformationswechsel an den Status posttranslationaler Modifikationen koppelt, reguliert es den Zellzyklus‑Fortschritt, Transkriptionsprogramme, die DNA‑Schadenssignalgebung und die Proteostase über mehrere kinasegetriebene Signalwege hinweg. Die Pin1‑Aktivität kann die Stabilität und Funktion zentraler Regulatoren wie p53, Cyclinen und Transkriptionsfaktoren beeinflussen und verbindet damit die Kontrolle von Proliferation und Stressantworten. Eine fehlregulierte PIN1‑Expression oder ‑Aktivität wird mit onkogener Signalgebung und neurodegenerativen Prozessen in Zusammenhang gebracht, wodurch PIN1 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur phosphorylierungsabhängigen Regulation darstellt.

Pin1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pin1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pin1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pin1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pin1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.